بحث كامل عن كرموتوغرافيا الفصل بالطبقة الرقيقة

كرموتوغرافيا الفصل بالطبقة الرقيقة

المقدمة

  هي تقنية تستخدم ل فصل مخاليط من المكونات. وذلك عن طريق: الطور الثابت: ويكون ذلك على لوح مغلف بطبقة رقيقة من المواد الممتزة على لوح من البلاستيك ، اوالزجاج، أو رقائق الألومنيوم، وهي وعادة هلام السيليكا، أكسيد الألومنيوم، أو السليلوز (نشافة الورق). ومن المعروف هذه الطبقة من المواد الممتزة تعرف بالطور الثابت. ويستخدم الفصل اللوني لفصل خليط من المواد إلى مكوناتها.

الطور المتحرك سائل معتمدة على الطور الثابت. و الطور المتحرك يتدفق عبر الطور الثابت ويحمل مكونات الخليط معه. المكونات المختلفة تسافر بمعدلات مختلفة. وذلك عبر الطبقة الرقيقة المغلفة بهلام السيليكا أو الألومينا على قطعة من المعدن، الزجاج أو البلاستيك القوي.

كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

 او الاستشراب اللوني بالطبقة الرقيقة هي طريقة لفصل المواد غير الطيارة في المخاليط⁽¹⁾  الكروماتوجرافيا أو التفريق اللوني هي طريقة لفصل وتنقية المواد الكيميائية المختلطة. باستعمال لوح من الزجاج او البلاستيك او المعدن وفي المغطاة بمادة ممتزه تساعد على الفصل. و تتم عملية الفصل على طبقة رقيقة من مادة الوسط الثابت المفروشة على الواح في الغالب مصنوعة من الالمنيوم.⁽²⁾كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة نقوم بفصل الخليط لمعرفة ألوانه لكن لا نحصل على مادة اللون بشكل محسوس حيث إن استخدامنا لل TLC أو (Thin Layer Chromatography) بهدف التعرف على مواد لون النبتة بشكل دقيق أكثر . و يعتمد الفصل في هذه الطرق اما على ظاهرة الادمصاص او ظاهرة الاستبدال الايوني .و هذه الظاهر تعتمد على تركيب كل طبقة من الوسط الثابت و الوسط المتحرك . الا ان تطبيقاتها المعتمدة على ظاهرة الادمصاص هي الشائعة حيث ينظر الى كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على انها كروماتوغرافيا ادمصاص ⁽³⁾

تستخدم في عمليات الفصل السريع و في تحليل الكميات القليلة من المواد و يعود ذلك للأسباب التالية :

1- بساطة الطريقة و عدم الحاجة الى اجهزة معقدة .

2- إمكانية الوصول الى جودة الفصل نفسها التي تعطيها الطرق الكروماتوغرافية الاخرى .

3- إمكانية الوصول الى فصل انتقائي باستخدام كواشف خاصة .

و تتم عملية الفصل على طبقة رقيقة من مادة الوسط الثابت المفروشة على الواح مصنوعة من الزجاج او البلاستيك او الالمنيوم .

و يعتمد الفصل في هذه الطرق اما على ظاهرة الادمصاص او ظاهرة الاستبدال الايوني .و هذه الظاهر تعتمد على تركيب كل طبقة من الوسط الثابت و الوسط المتحرك . الا ان تطبيقاتها المعتمدة على ظاهرة الادمصاص هي الشائعة حيث ينظر الى كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة على انها كروماتوغرافيا ادمصاص .

خطوات العمل بكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة :

1- تجهيز الواح الطبقة الرقيقة .

2اختيار الوسط المتحرك المناسب.

3- وضع عينة على لوح الطبقة الرقيقة .

4- تظهير البقع المفصولة و التعرف على مكوناتها.

5- حساب معامل الاعاقة Rf(Refracive index)

 (1) تجهيز الواح الطبقة الرقيقة ( الوسط الثابت) :

ان المواد المدمصة في TLC هي نفسها المدمصة في كروماتوغرافيا الاعمدة .

هذه الالواح تكون مصنوعة و مجهزة للاستخدام مباشرة .

 (2) اختيار المذيب المناسب (الوسط المتحرك)

يعتمد اختيار المذيب على نوع المادة المراد فصلها و قد يكون ضروريا اختيار عدد من المذيبات لاجراء عملية الفصل و يكون الاختيار التقريبي سهلا .فالمذيب الذي له قطبية عالية يؤدي الى تحريك البقع مع جبهة المذيب، في حين ان المذيب غير القطبي لا يؤدي الى تحريك البقع مع المذيب ، و يعتبر الكلوروفورم و البنزين من المذيبات المتوسطة القطبية التي تستخدم بصورة واسعة لفصل العديد من المركبات .

 (3) وضع العينة

يتم وضع حجم معين في حدود 5-20 ميكرولتر من العينة التي تركيزها 0.1-5% بواسطة ماصة دقيقة او محقن دقيق على خط نقطة البداة الذي بيعد 2 سم من احد اضلاع اللوح .

و ينبغي الا يزيد قطر البقعة عن 1سم . و للمحافظة على بقاء البقعة صغيرة توضع العينة باحجام صغيرة عدة مرات مع التجفيف بعد كل اضافة.

 (4) طرق تظهير البقع المفصولة (Visualization Method)

طرق الفصل سهلة في حالة المواد المفصولة ملونة ، الا انه في اغلب الحالات تكون المواد المفصولة عديمة اللون و يجب جعلها في هذه الحالة ملونة باستعمال بعض الكواشف ، و تسمى هذه بكواشف التظهير .

يعتبر اليود من اكثر كواشف التظهير استخداما حيث يتفاعل مع اغلب المواد العضوية معطيا متراكبات لها الوان اما بنية او صفراء . و هناك طرق اخرى مثل تظهير هاليدات الالكيل برش لوح الطبقة الرقيقة بمحلول مخفف من نترات الفضة حيث تتكون هاليدات الفضة التي تتفكك بتأثير الضوء معطية بقع سوداء من رقائق الفضة على الطبقة الرقيقة .

ايضا هناك استخدام مصباح الاشعة فوق البنفسجية و هي غالبا ما تظهر المركبات المفصولة على شكل بقع براقة ساطعة على الطبقة الرقيقة و بعضها يظهر عليه فقط خاصية التالق(Flourescence) .

و هناك ايضا اضافة مادة متالقة الى الوسط الثابت في الطبقة الرقيقة مثل خليط من كبريتات الزنك و الكادميوم . و اذا كانت المركبات المفصولة تسبب اخماد التالق (quenching flourescence) فانها ستظهر على هيئة بقع سوداء على الصفيحة عند تعرضها للاشعة فوق البنفسجية .

 (5) معامل الاعاقة

عند تثبيت كل الظروف على الطبقة الرقيقة و التي تشمل :

1-المذيب المستخدم.

2- المادة المدمصة المستخدمة كوسط ثابت .

3- سمك الطبقة الرقيقة

4- كمية العينة.

فإن اي مركب سيقطع مسافة ثابتة بالنسبة الى المسافة التي تقطعها جبهة المذيب . و تعرف النسبة بين المسافة التي تقطعها المادة المفصولة و المسافة التي تقطعها الجبهة المذيب بمعامل الاعاقة و يرمز لها بالرمز Rf

و معامل الاعاقة = المسافة التي تقطعها المادة \المسافة التي تقطعها جبهة المذيب

و يكون معامل الاعاقة ثابتا للمركب المعطى عندما تكون كل ظروف التجربة هي  نفسها و هو يمثل احد الصفات الفيزيائية لهذا المركب .

و يمكن التعرف الى المادة المجهولة عن طريق حساب تلك المسافات من نقطة البداية الى مركز القطعة .

المواد المطلوبة و تحضير المحاليل :

1-هلام السيليكا

2-كلوروفورم

3-اسيتون

4-بنزين

5- كحول ايزوبروبيلي

6- ايثر البترول الخفيف الذي درجة غليانه تتراوح بين 30-50م

7- رمل معالج بحمض الهيدروكلوريك

8- حضر 25مل من كل من الكلوروفورم و الكاروتين و الكزاينوفيل في الكلوروفورم بتركيز 10% وزن لوزن w/w .

خطوات العمل

(1)حضر الواح الطبقة الرقيقة و ذلك بمزج كمية مناسبة من هلام السيليكا مع 3 مل من مزيج مكون من 1 مل كحول ميثيلي و 2 من الكلوروفورم ثم افرش العجينة على سطح لوح زجاجي باستخدام قضي زجاجي .

(2)استخلص المادة الخضراء من السبانخ و ذلك بأخ 1 جرام من السبانخ و طحنها في هاون صغير مستخدما 5 مل من الاسيتون أو الكلوروفورم مع اضافة كمية مناسبة من الرمل و ذلك لتسهيل عملية الطحن . و افصل المذيب الذي يحوي المادة الخضراء بعد الطحن الجيد.

(3)ضع على لوح الطبقة الرقيقة و على مسافة 2 سم من حافتها مستخلص السبانخ على شكل قطرات متتالية.

(4)ضع على لوح الطبقة الرقيقة نفس وعلى بعد 2 سم من حافة محاليل كل من الكلوروفيل و الكاروتين و الكازاينوفيل على شكل قطرات متتالية بحيث تكون المسافة ما بين البقع الناتجة عن المكونات بحدود 2 سم .

(5) ضع لوح الطبقة الرقيقة في الخزان الكروماتوجرافي الذي يحوي المذيب المكون من البنزين و إيثرر الرول و الكحول الأيزوبروبيلي بنسب حجمية   5  :  5  : 1 على التوالي . وينبغي ألا يصل مستوى سطح المذيب في الخزان الى بقعة العينة المراد فصل مكوناتها .

 (6)اترك لوح الطبقة الرقيقة في الخزان حتى تصل جبهة المذيب الى ما قبل نهاية الطرف العلوي .

(7)أخرج لوح الطبقة الرقيقة ولاحظ انفصال مكونات العينة إالى عدة بقع ملونة ، رتب هذه البقع حسب قوة ادمصاصها و احسب معامل الاعاقة لكل منها . وتعرف على مل مكون تم فصله من السبانخ بمقارنة لونه و معامل إعاقتع بلون و معامل الاعاقة لكل من الكلورفيل و الكاروتين و الكزاينوفيل .

 

تطور البقعة البنفسجية إلى بقعة حمراء وزرقاء منفصلة في لوح ال TLC.

فروق TLC عن كروموتغرافيا العمود

هنالك فروق متعددة ما بين طريقة الفصل "كروموتغرافيا العمود" وطريقة الفصل "كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة “ ومن بينها :

الفرق بين كروموتغرافيا العمودوكروموتغرافيا الطبقة الرقيقة
كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة	كروموتغرافيا العمود
أما في كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة فلا نستطيع الحصول على المواد منفصلة لأنها تبقى على الورقة، او بعبارة أخرى لا نستطيع استخلاص مواد من خلال كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة لكن في كروموتغرافيا العمود نستطيع الحصول عليها.	في كروموتغرافية العمود نقوم بفصل المواد المكونة للخليط فعلياً ونستطيع في النهاية الحصول على كلمادة بشكل منفرد
بالإضافة إلى انه في كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة نحصل على مواد الخليط بشكل أدق	في كروموتغرافيا العمود اقل دقة (يحدث ذلك لقصر عمود الكروموتغرافيا، وكذلك لان عملية فصلنا للمواد محدودة بوقت قصير فلو انتظرنا يومان أو ثلاثة من الممكن أن نحصل على المواد بشكل أدق)
نستطيع أن نستعمل ال [TLC] لان عملية الفصل بين المواد فيها أسرع أي بحاجة إلى وقت اقل	في كروموتغرافيا العمودفنحتاج إلى وقت أكبر للفصل بين المواد.
في كروموتغرافيا الطبقة الرقيقة [TLC] نقطة واحد من الخليط تكفينا لكي نفصل مركباته مما يجعلنا نوفر كمية الخليط المستخدمة في التجربة حيث أننا نستطيع استخدام الكمية المتبقية منه	أما في كروماتغرافيا العمود فنحتاج إلى كمية كبيرة جدا مقارنة بال [TLC].

من كروموتغرافيا العمود، ففي 5 دقائق تقريبا حصلنا على مركبات الخليط وعرفنا مركباته (في كروموتغرافيا الـ [TLC])، أما في كروموتغرافيا العمود

التقنية العملية

عملية مشابهة لكروماتوغرافياالورق مع ميزةالسرعة،الفصل ألافضل ، والاختيار بين مراحل مختلفة ثابتة. بسبب بساطته وسرعته غالبا ما تستخدم[TLC] لرصد تفاعل كيميائي وللتحليل النوعي لمنتجات التفاعل.

 

كروماتوغرام 10 من الزيوت الأساسية الملونة مع كاشف فانيليا .

الطريقة التحليليه

نضع نقطة او بقعة صغيرة من المحلول تحتوي على العينة على اللوح الرقيق، حوالي 1.5 سم من الحافة السفلى. والمذيب يسمح له بالتبخر التام ، وإلا سوف يتحقق فصل سيئ للغاية أو لا يحدث فصل . إذا تم استخدام مذيب غير متطائر لاذابة العينة، لا بد من تجفيف لوح الفصل في الحاوية الفراغية.

وهناك كمية من مذيب مناسب تمثل الطور المتحرك تسكب في كأس زجاجي أو أي حاوية شفافة مناسبة (غرفة الفصل إلى عمق أقل من 1 سنتيمتر.

يتم وضع شريط من ورق الترشيح ويعرف أيضا باسم "الفتيل" في غرفة الفصل، بحيث تلامس القاع المذيب، وتمس جدار غرفة الفصل وتصل تقريبا إلى قمة الحاوية.

يتم إغلاق الحاوية بغطاء من الزجاج أو أي غطاء آخر ويترك لبضع دقائق للسماح لأبخرة المذيبات تصعد ورقة الترشيح وتشبع الهواء في الغرفة. عدم تشبع الغرفة سيؤدي إلى فصل ضعيف والنتائج غير قابلة للتكرار. ثم يتم وضع لوح في قاع TLC بحيث البقعة (ق) من العينة لا تلمس سطح الطور المتحرك في الغرفة، ويتم إغلاق الغطاء. والمذيب يتحرك صعودا اعلى اللوح بالخاصية الشعرية، ويجتمع خليط العينة ويحمل عنه لوحة (elutes العينة.

عندما يصل المذيب القمة يجب إزالة اللوح لان(استمرار الشطف سوف تعطي نتيجة مضللة) والمجففة.⁽⁴⁾

الخطوة 1                       الخطوة 2                          الخطوة 3

 الخطوة 4               الخطوة 5            الخطوة 6           الخطوة 7

تقنية الفصل:

يتم الفصل بهذه الطريقة بوضع قطرة من المحلول الذي يحتوي على الخليط المراد فصل مكوناته على بعد 2سم من احد اضلاع اللوح . ثم يوضع اللوح في وعاء مغطى يحتوي على كمية من المذيب المستخدم بحيث لا يزيد ارتفاع المذيب في الوعاء عن 1سم . و بعد وقت قصير يبدأ المذيب في التحرك الى اعلى مارا بالبقعة التي تحتوي على الخليط و يبدا فصل مكوناته حسب قوة ادمصاص كل منها على سطح الوسط الثابت ، و ينتج عن ذلك فصل بقعة الخليط الى عدة بقع . و عندما تقترب جبهة المذيب من نهاية اللوح نخرج اللوح من الوعاء و نقوم بتحديد المكان الذي وصلت اليه جبهة المذيب لمعرفة المسافة التي قطعها المذيب . ثم نحدد مواقع البقع المفصولة . و تقاس المسافة التي قطعتها البقع مباشرة اذا كانت هذه المواد المفصولة ملونة اما اذا كانت غير ملونة فلابد من اتباع احد الطرق المذكورة سابقا لتظهير البقع .

فصل مكونات نبات السبانخ الاخضر بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة

تعتمد طريقة فصل مكونات النبات الاخضر على اختلاف ادمصاص المادة الخضراء على سطح هلام السيليكا الموجودة على شكل طبقة رقيقة . و تشبه هذه الطريقة الى حد كبير طريقة الفصل الكروماتوغرافي بواسطة العمود .

عملية الفصل

المركبات الكيميائية المختلفة في العينة الخليط تهاجر بمعدلات مختلفة بسبب الاختلافات في الفتها نحو الطور الثابت، وبسبب الاختلافات في قابليتها للذوبان في المذيبات . عن طريق تغيير المذيبات، أو ربما باستخدام مزيج، وفصل مكونات يقاس R الفرعي القيمة يمكن تعديلها.

أيضا، يمكن استخدام الفصل يتحقق مع لوحة TLC لتقدير انفصال فلاش اللوني معرض العمود ويستند الفصل بين المركبات على المنافسة من المذاب والطور المتحرك عن أماكن ملزمة لمرحلة ثابتة.

على سبيل المثال ،يمكن استخدام هلام السيليكا في المرحلة الطبيعية كمرحلة ثابتة و نظر فيه القطبية. نظرا الي الاختلاف في الاستقطاب، فالمركب ألاكثر قطبية يحتوي على تفاعل أقوى مع السيليكا، وبالتالي أكثر قدرة على تبديد الطور المتحرك من أماكنه . وبالتالي، فإن العنصر الأقل قطبية يتحرك على مستوى اعلى لوحة (مما أدى إلى ارتفاع قيمة RF).

إذا تغير الطور المتحرك إلى المذيبات القطبية أكثر أو خليط من المذيبات، فمن أكثر قدرة على تبديد المواد المذابة من الأماكن والمركبات ملزمة السيليكا كل شيء على لوحة TLC سوف تتحرك على مستوى اعلى لوحة.

السائد القول ان "المذيبات القوية" (elutants) مركبات اكثر دفعا خلال لوح التحليل ، في حين أن "المذيبات الضعيفة" elutants تتحرك بصعوبة بالغة . ترتيب القوة / الضعف يعتمد على طلاء (الطور الثابت) من لوحة TLC . لوحات هلام السيليكا TLC المغلفة، ويزيد من قوة elutant وفقا للترتيب التالي:

Perfluoroalkane (أضع، الهكسين، بنتان، رابع كلوريد الكربون ، البنزين /  التولوين ، ثنائي كلورو ميثان،  ايثر ، Ethylacetate، الأسيتونيتريل، الأسيتون، 2- بروبانول / N-بيوتانول ، المياه، الميثانول، الترايثلامين ، حمض الخليك، حمض الفورميك (أقوى). ل C18 لوحات مطلية النظام هو عكس ذلك.

عمليا هذا يعني أنه إذا كنت تستخدم خليط من اسيتات والهكسان والطور المتحرك، مضيفا النتائج خلات الإيثيل أكثر في قيم أعلى الترددات اللاسلكية لجميع المركبات على لوحة TLC. تغيير قطبية الطور المتحرك وعادة لا يؤدي إلى عكس ذلك من تشغيل للمركبات على لوحة TLC . إن سلسلة eluotropic يمكن أن تستخدم كدليل في اختيار الطور المتحرك. إذا هو المطلوب من نظام تشغيل عكس من المركبات، يجب استخدام مرحلة عديم الأقطاب ثابتة، مثل C18-functionalized السيليكا.

مثالا على ذلك اللوني من مستخرج من أوراق خضراء (على سبيل المثال السبانخ) في 7 مراحل التنمية. كاروتين أزل بسرعة ومرئيا فقط حتى الخطوة 2. الكلوروفيل A و B في منتصف الطريق في الخطوة الأخيرة وتين في تلطيخ أول مركب الصفراء⁽⁵⁾

 

روابط مكونات مع طور ثابت من السلكا جل TLC